A fluorescência observada, em um teste positivo, resulta da ligação direta de autoanticorpos primários da amostra com fluorocromo (ex.: FITC) conjugado aos antígenos nucleares presentes nas células HEp-2, permitindo detecção simultânea de anticorpos IgG, IgA e IgM da amostra sérica.

O princípio da IFI baseia-se na formação de complexos imunes revelados por anticorpos secundários anti-imunoglobulina humana marcados com fluorocromo (ex.: FITC), os quais reconhecem imunoglobulinas séricas humanas previamente ligadas aos antígenos nucleares presentes nas células HEp-2.

A principal vantagem do substrato HEp-2 é a elevada concentração de um único antígeno nuclear dominante, o que reduz a variabilidade dos padrões de fluorescência e aumenta a reprodutibilidade Inter observador.

Uma pesquisa positiva de autoanticorpos séricos em células HEp-2, em baixos títulos, correlaciona-se à presença de doença reumática autoimune sistêmica.