Um ciclo de PCR consiste em desnaturação, hibridização ou annealing e extensão enquanto que a PCR em tempo real associa a metodologia de PCR a um sistema de detecção de fluorescência no tubo de reação à medida que DNA dupla fita é gerado e sua quantificação produzida durante os ciclos de amplificação.

Apesar da PCR em Real-time estar padronizada para os vírus do herpes simples, varicella Zoster, citomegalovírus etc, na rotina assistencial de alguns laboratórios de referência seu emprego é limitado para determinação da carga viral por falta de disponibilidade de kits comerciais bem padronizados. Dentre eles podemos citar o HIV-1 e 2 e os vírus das hepatites.

Entre as vantagens do Real-time PCR temse que: não é influenciado por amplificação não específica; a amplificação pode ser monitorada em tempo real; não ocorre processamento pós-PCR (baixo risco de contaminação); Ciclagem ultra-rápida (30 minutos a 2 horas); Requer 1000x menos RNA que os ensaios convencionais; confirmação da amplificação específica em tempo real; maior sensibilidade e precisão, reprodutibilidade e acurácia.

Por meio do monitoramento da taxa de aumento da fluorescência na reação de PCR, é possível determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente na amostra original. A qPCR pode ser utilizada para se avaliar a presença de um patógeno em uma amostra, podendo ser um teste qualitativo ou quantitativo.

A elevada sensibilidade do qPCR possibilita excelentes resultados, porém também está sujeita a presença de inibidores e contaminação que podem afetar a sua eficiência. Os plásticos tem grande impacto sobre os ensaios em tempo real e precisam receber um tratamento especial para não interferir na reação, principalmente na leitura do sinal fluorescente. Ocasionam assim um resultado errado, com baixa concentração ou mesmo inviabilizando o processo.