O meio de cultura normalmente utilizado para realização da metodologia de disco difusão é o ágar colúmbia, com discos de papel-filtro impregnados com concentração padronizada de antimicrobianos, e suspensão bacteriana equivalente à escala 0,5 de McFarland.

Entre as classes de antimicrobianos testadas, as quinolonas são amplamente utilizadas na clínica, atuam na síntese da parede bacteriana, sendo a produção de beta-lactamases o principal mecanismo de resistência.

Em bacilos gram-negativos, o mecanismo de resistência aos macrolídeos, lincosaminas e estreptogramisnas pode ser determinado por metodologia de disco difusão, utilizando os discos de clindamicina e eritromicina dispostos lado a lado, no denominado teste D.

As fitas de gradiente de concentração combinam o princípio do disco difusão com a diluição e utilizam os critérios interpretativos da diluição. Podem ser utilizadas para uma variedade de microrganismos incluindo gram-positivos, gram-negativos e leveduras.

Cefalosporinas de terceira geração, como ceftriaxona e cafotaxima, são consideradas marcadores para triagem de carbapenemases em bacilos gram-negativos.