Na análise MALDI, o laser é utilizado para irradiar amostras biológicas em associação com compostos químicos (matriz), os quais permitem a absorção da energia, com consequente ionização dos peptídeos.

Uma vez ionizados, os peptídeos seguem para o analizador TOF (time of flight). Os íons gerados são então separados em um tubo de vácuo, em razão da relação m/z que apresentam.

Os íons de menor relação m/z são os primeiros a chegar ao detector.

No modo linear de operação de um espectrômetro MALDI-TOF, os íons gerados percorrem uma trajetória linear e os íons chegam ao detector presente no final do tubo, o que resulta em uma melhora na resolução e auxilia na análise de diferentes íons com a mesma relação m/z.

No modo de operação reflectron de um equipamento MALDI-TOF, a trajetória dos íons é alterada por um espelho disposto no final do tubo, sendo então enviados a outro detector.